5-نوکلئوتیداز (5-nucleotidase) آنزیمی است که باعث جدا شدن فسفوریلیتیک 5’nucleotides می شود.اگرچه در اصل در زهر مار یافت می شود ، اما فعالیت 5’nucleotidase در باکتری ها و سلول های گیاهی نیز وجود دارد ، و به طور گسترده ای در بافت مهره داران توزیع شده است. در سلول های پستانداران ، این آنزیم عمدتا در غشای پلاسمایی قرار دارد و نقش اصلی آن در تبدیل نوکلئوتیدهای خارج سلول (به عنوان مثال 5′-AMP) ، که عموماً غیرقابل نفوذ هستند ، به نوکلئوزید مربوطه (به عنوان مثال آدنوزین) است که به راحتی می تواند در اکثر سلولها وارد شود. . در نتیجه ، آنزیم نقش اساسی در متابولیسم نوکلئوتیدها دارد.
آنزیم بستر گسترده ای برای نوکلئوتیدها دارد و نشان داده شده است که 5’nucleotides را به سرعت هیدرولیز می کند ، ریبوز -5-فسفات را به آرامی و سایر استرهای فسفات به آرامی (اگر اصلاً) نشان دهند.